Die als Neustadt bezeichnete Siedlungsbereich vor der Stadt Cölln wurde 1674 mit Stadtprivilegien ausgezeichnet und kurze Zeit später zu Ehren der Kurfürstin Dorothea, der zweiten Frau des Großen Kurfürsten Friedrich Wilhelm I., in Dorotheenstadt umbenannt.
Aufgrund der starken Zuwanderung wuchs die Stadt rasch an und eine erste Kirche wurde 1678 errichtet, die für reformierte und lutherische Gemeinde gleichzeitig zur Verfügung stand. Mitte des 19. Jahrhunderts wurde die Kirche im spätklassizistischen Stil grundlegend neu aufgebaut.
Im Zweiten Weltkriegt wurde die Dorotheenstätische Kirche von Bomben getroffen und brannte aus. Die Überreste wurden 1965 beseitigt und auf dem Platz befindet sich heute ein Parkplatz. Die Kirchengemeinde fusionierte 1962 mit der Friedrichwerderschen Kirchengemeinde.

Die Kirche beherbergte das Wandrelief vom Grabmal des Grafen Alexander von der Mark (1779-1787), einem unehelichen Sohn von Königs Friedrich Wilhelm II., der im Alter von 9 Jahren vermutlich vergiftet wurde. Es ist eines der frühsten Werke des Bildhauers Johann Gottfried Schadow und hat aufgrund der einfühlsamen Gestaltung zum Erfolg des Künstlers beigetragen. Heute befindet sich die Grabplatte in der Alten Nationalgalerie.

Ebenfalls in der Kirche befand sich eine Kopie des Lutherstandbildes, welches Johann Gottfried Schadow für Wittenberg anfertigte. Die Statue wurde vor dem Bombenangriff aus der Kirche gerettet und steht heute auf dem Dorotheenstädtischen Friedhof.