In seiner Schrift „ An die Ratsherren aller Städte deutschen lands, daß sie christliche Schulen aufrichten und halten sollen“ (1524) forderte Martin Luther die Städte zum Ausbau der höheren Schulen auf, um der Bevölkerung Sprachkenntnisse der biblischen Sprachen zu vermitteln, daneben aber auch Geschichtsunterricht, Singen und Musik bis hin zur Mathematik zu lehren. Mehr noch für den Unterricht in den freien Künsten zu sorgen. Selbst für Mädchen wareine einfache Schulbildung vorgesehen.

Unterstützt wurde Luthers Konzeption durch den Philologen Philipp Melanchthon, der wie kein anderer zu einer Systematisierung der Lehre Luthers beigetragen hat und  zugleich der Reformation eine starke humanistische Prägung gab. So war es schließlich auch Melanchthon, der durch unermüdliche Vermittlungsarbeit die Reformation im Kurfürstentum Brandenburg vorantrieb.

Im Vergleich mit anderen oberdeutschen Städten war Berlin mit der Übernahme von humanistischen Gedankengut eher rückständig. Es gab Schulen an den Pfarrkirchen oder an der Franziskaner-Klosterkirche. Durch die Erhebung Berlins zur Residenzstadt und schließlich der Einführung eines ausgedehnten Verwaltungsapparates war eine akademische Bildung notwendig. Die meisten Studenten besuchten auswärtige Universitäten wie Erfurt, Rostock oder Prag. Ab 1478 wurde für einige Jahre das Generalstudium der Dominikaner nach Berlin verlegt und so entstand im Dominikanerorden die erste Hochschule. Kurfürst Joachim II. gründete schließlich 1506 mit Genehmigung des Papstes als erste Brandenburgische Landesuniversität die Alma Mater Viadrina zu Frankfurt (Oder). Dem erbitterten Gegner der Reformation wurde die neue Universität schnell zu einem Bollwerk gegen die ‚Ketzeruniversität‘ in Wittenberg und so kam es auch, dass Luther selbst niemals die Mark Brandenburg besuchte. Kurfürstin Elisabeth hingegen wendete sich dagegen der Reformation zu und floh vor ihrem Mann nach Sachsen.

Der gemeinsame Sohn wurde später als Joachim II. Kurfürst und hegte ebenfalls Sympathien für die reformatorischen Gedanken, obwohl er selbst nie mit Luther zusammentraf. Schließlich forderten auch die Berliner Bürger die Einführung der Reformation und 1539 trat der Kurfürst in der Spandauer St.-Nikolai-Kirche zum evangelischen Bekenntnis über, indem er das Abendmahl mit Brot und Wein (beiderlei Gestalt) feierte.

Eine Kommission zur Erarbeitung der reformierten Brandenburgischen Kirchenordnung wurde von Philipp Melanchthon beraten, der schon 1535 und 1538 den brandenburgischen Hof besuchte und für die reformatorische Sache warb. Neben Melanchthon arbeitete Georg Buchholz an der neuen Kirchenordnung mit, ein ehemaliger Student Luthers, der sowohl mit dem Reformator als auch mit Melanchthon regelmäßig Kontakt hielt. Mit der Einführung der Reformation 1539 wurde Buchholz schließlich erster Propst von Berlin, aber 1565 wegen Streitigkeiten mit Kurfürst Joachim II. von diesem wieder abgesetzt. Die Kirchenordnung druckte 1540 der Wittenberger Buchdrucker Hans Weiß und schuf damit den ersten in Berlin hergestellten Bruchdruck.

Die Reformation führte nach und nach zur Schließung der Klöster in der Stadt. Die Armenfürsorge verwalteten zunächst die Stadträte, das Franziskaner-Klosterstift wurde nach dem Tod des letzten Franziskanerbruders 1571 geschlossen. Einige Jahre später zog hier die erste Berliner Druckerei ein und kurz drauf wurde im Klostergebäude das Berlinische Gymnasium zum Grauen Kloster eröffnet, das sich in der Folge um eine humanistische Bildung in der Stadt verdient machte und zahlreiche spätere Berliner Persönlichkeiten ausbildete.

Melanchthon widmete sich zeitlebens der Visitation und Gründung von Schulen. Er verfasste zahlreiche Lehrbücher und wurde unter anderem als „Praeceptor Germaniae“ (lat: „Lehrer Deutschlands“) berühmt. Verschiedene seiner Grundsätze haben das Schulwesen geprägt. Dazu gehört die Aufteilung in Klassen nach Alter und Wissen, aber auch die Einführung des Religionsunterrichts im allgemeinen Schulwesen.